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万历二年(1574年)，出任会试同考官，之后历任翰林院编修、日讲官兼经筵讲官。因关于忠孝的言论使张居正认为沈一贯在讽刺自己，长期被闲置不用。张居正死后改任左春坊左中允兼翰林院编修，历任侍读学士、右春坊右谕德、吏部左侍郎兼侍读学士，加太子宾客。万历十二年(1584年)，升作詹事府少詹事，兼翰林院侍读学士，教习庶吉士，为郭正域师。万历二十二年(1594年)，皇帝重新任命沈一贯为南京礼部尚书，不久后又让他成为正史副总裁，协理詹事府，但沈一贯并未赴任。

万历二十九年(1601年)十一月，成为当朝首辅。万历朝中，苛捐杂税，尤以矿税为重。税吏趁机横征暴敛，民间怨声载道。万历三十年(1602年)2月，万历帝突然染疾，急召首辅沈一贯和诸内阁大学士到启祥宫后殿西暖阁议事。万历帝说:"我已病重，在位已久，已没有什么憾事了。我将太子托付给你，要尽力辅佐。初设矿税矿监，实出不得已，因京城大殿未能完工。现工程可以叫停，矿监也可统统召回。释放囚禁很久的囚犯，因上书建言而获罪的诸位大臣都官复原职，并接受给事中和御史大夫的谏言。"万历帝言毕，沈一贯即恸哭，太后、太子、诸王群臣都哭了起来。沈一贯遂立马拟旨。当夜，群臣都在宫中通宵议拟。